MICRROARRAY

MICRROARRAY

A.  Latar Belakang

Seluruh gen manusia telah berhasil ditentukan urutan nukleotidanya. Persoalan yang kini dihadapi oleh para ahli biologi molekuler adalah melakukan analisis dan menentukan struktur dan fungsi gen serta pemetaan hubungan gen satu dengan lainnya. Analisis ini sangat bermanfaat untuk mengenali lebih jauh mengenai proses normal biokimia dan fisiologi yang terjadi di dalam tubuh manusia dan organisme lainnya. Analisis ini juga akan dapat membantu manusia untuk mengenali keadaan patologis seseorang serta dapat memperkirakan proses tanggapannya terhadap adanya rangsang dari luar, misalnya terhadap pemberian obat. Pemahaman tentang sistem kesehatan yang didasarkan pada analisis genomik saat ini telah melahirkan suatu cabang disiplin ilmu baru yang dinamakan Farmakogenomik. Salah satu teknologi utama yang digunakan untuk pengembangannya adalah DNA microarray.

B.  Definisi Microarray

Micoarray merupakan chip yang berukuran kecil yang terbuat dari lempengan kaca yang berisi ribuan bahkan puluhan ribu macam gen dalam bentuk fragmen DNA yang berasal dari penggandaan cDNA. Fragmen DNA yang memuat gen tersebut dapat mengenali gen dalam suatu sampel jaringan yang dianalisis. Pola ekspresi suatu gen dalam jaringan yang berbeda pun juga dapat diamati dengan menggunakan teknik ini. 

Sebenarnya prinsip kerja dari microarray adalah mengukur jumlah hibridisasi mRNA pada cDNA dalam chip tersebut. Pada umumnya analisis dengan menggunakan microarray menggunakan dua sampel yang berbeda, misalnya sel kulit normal dengan sel kanker kulit. Kedua sampel tersebut diisolasi mRNA-nya dan kemudian diletakkan dalam chip microarray. Kemudian chip tersebut diberi penanda radioaktif untuk menghasilkan warna fluorosens setelah dilakukan scanner yang terhubung dengan komputer. Kemudian komputer akan menganalisis kedua sampel tersebut berdasarkan pola warna yang ada. 

Meskipun semua sel dalam tubuh manusia mengandung materi genetik yang identik, namun gen yang sama tidak aktif dalam setiap sel. Belajar gen mana yang aktif dan mana yang tidak aktif dalam tipe sel yang berbeda membantu para ilmuwan untuk memahami bagaimana kedua sel-sel ini berfungsi secara normal dan bagaimana mereka terpengaruh ketika berbagai gen tidak melakukan dengan benar. Di masa lalu, para ilmuwan hanya mampu melakukan analisis genetik pada beberapa gen sekaligus. Bagaimanapun, dengan perkembangan teknologi DNA microarray, sekarang para ilmuwan dapat memeriksa bagaimana ribuan gen aktif pada waktu tertentu.

Untuk melakukan analisis probe dengan menggunakan teknik microarray terdiri dari beberapa tahapan, antara lain: 

1.    Mengumpulkan sel atau jaringan yang akan dianalisis

2.    Isolasi mRNA dengan menggunakan primer poly-T

3.    Membuat cDNA yang diberi fluoresens

4.    Hibridisasi

5.    Pembacaan dengan menggunakan laser

 

C. Kegunaan Microarray

Aplikasi microarray banyak digunakan dalam deteksi kanker, dimana sen kanker mengalami abnormalitas dalam mengekspresikan gennya. Teknologi ini juga memungkinkan untuk mengetahui tahapan perkembangan sel kanker dengan melihat level ekspresinya terhadap probe spesifik yang telah terdapat pada chip microarray. Dalam analisis ini digunakan sampel DNA normal dan DNA kanker atau tumor. Kedua jenis DNA ini kemudian diamplifikasi dan masing-masing diberi pewarna fluorescent yang berbeda satu sama lain. Pada contoh yang ditampilkan, DNA normal diberi warna hijau, dan DNA tumor memiliki warna merah. Setelah proses hibridisasi, tiap DNA akan memancarkan cahaya sesuai dengan zat warna yang dibawa masing-masing. Bila DNA membawa ekspresi normal dan tumor, maka akan muncul wana lain, seperti kuning. Namun bila tidak ada DNA yang mampu melakukan hibridisasi dengan probe, pewarna tidak terekspresi dan terlihat berwarna hitam. Warna tersebut kemudian dibaca oleh detektor dan diubah menjadi data grafik sehingga dapat dianalisis secara kuantitatif.

D. Tujuan DNA microarray

·         Mendeteksi RNA (paling sering sebagai cDNA setelah transkripsi balik) yang mungkinatau tidak akan diterjemahkan menjadi protein.

·         Mampu menganalisis ekspresi seluruh gen yang terdapat didalam sel manusia sehinggamembantu manusia dalam melakukan identifikasi seluruh sifat yang melekat padaseseorang.

·         Membantu dalam identifikasi gen baru, mengetahui tentang fungsi dan tingkat ekspresimereka dibawah kondisi yang berbeda.

·         Membantu manusia dalam memonitoring, mendiagnosa, dan memprediksi suatu penyakit.

E. Jenis DNA Microarray

Ada banyak jenis array dan dengan berdasarkan perbedaan pengaturan spasial pada suatu permukaan yang dikodekan:

1. Tradisional fase padat-array

yaitu kumpulan teratur mikroskopis "spot", yang disebut fitur, masing-masing dengan probe yang spesifik yang melekat pada permukaan padat seperti kaca, plastik atau silicon biochip (umumnya dikenal gen chip, genom chip, chip DNA atau gen array).Ribuan dari mereka dapat ditempatkan di lokasi yang dikenal pada satu DNA microarray.

2. The alternative bead array

yaitu kumpulan mikroskopis polystyrene bead, masing-masing dengan probe yang spesifik dan rasio dari dua atau lebih pewarna, yang tidak mengganggu neon pewarna yang digunakan dalam sekuens target.

Jenis microarray tersebut tergantung pada jenis sampel yang digunakan untuk bergerak untuk membangun sebuah array dan informasi yang masuk akal, eksperimen microarray dapat dikategorikan dalam tiga cara:

a. Analisis microarray Expression

Pada konfigurasi percobaan ini, cDNA berasal dari mRNA dari gen yang dikenal bergerak. Sampel gen dari kedua yang normal dan jaringan yang sakit. Bercak dengan lebih banyak intensitasnya diperoleh untuk gen-gen jaringan berpenyakit , jika gen diekspresikan secara berlebihan dalam kondisi sakit . Pola ekspresi ini kemudian dibandingkan dengan pola ekspresi gen bertanggung jawab untuk suatu penyakit.

b. Microarray untuk analisis mutasi

Untuk analisis ini, peneliti menggunakan gDNA. Gen yang mungkin berbeda satu sama lain oleh kurangnya satu basa nukleotida. Salah satu perbedaan mendasar antara kedua sekuens dikenal sebagai polimorfisme nukleotida tunggal (SNP) dan mendeteksi mereka dikenal sebagai deteksi SNP

F. Cara kerja DNA microarray

DNA microarray dikerjakan oleh mesin robot yang menyusun dalam jumlah kecil dari ratusan atau ribuan rangkian gen pada slide mikroskop tunggal. Peneliti memiliki database lebih dari 40.000 rangkaian gen yang digunakan untuk tujuan ini. Ketika gen diaktifkan, mesin seluler mulai mengcopy segmen tertentu dari gen itu. Produk yang dihasilkan disebut messenger RNA (mRNA), merupakan template untuk membuat protein.  mRNA yang dihasilkan oleh sel adalah komplementer dari sel yang disalin , oleh karena itu akan berikatan dengan bagian original (asli) dari untaian DNA yang dicopy. Untuk menentukan gen mana yang diaktifkan dan mana yang dimatikan, terlebih dulu peneliti harus  mengumpulkan molekul mRNA hadir dalam sel itu. Lalu peneliti melabel setiap molekul mRNA dengan  enzim transcriptase (RT) yang bersifat reversibel sehingga diperleh cDNA komplementer dengan mRNA. Selama proses fluoresen nukleotida akan melekat dengan cDNA. Tumor dan sampel normal diberi label dengan pewarna fluorescent yang berbeda. Selanjutnya, peneliti menempatkan cDNA berlabel ke slide DNA microarray. cDNA  berlabel yang merepresentasikan mRNA dalam sel kemudian akan berhibridisasi - atau saling mengikat - untuk mensintesis komlementer DNA yang melekat pada slide microarray dan meninggalkan fluoresennya. Kemudian menggunakan scanner khusus untuk mengukur intensitas fluorescen untuk setiap tempat/daerah pada slide microarray. Jika gen tertentu sangat aktif, akan banyak menghasilkan molekul RNA , dengan demikian, lebih banyak cDNA berlabel , dan mana yang berhibridisasi dengan DNA pada slide microarray sehingga menghasilkan area fluorensen yang sangat cerah. Gen yang agak kurang aktif menghasilkan sedikit menghasilkan mRNA, dengan demikian , cDNA berlabel kurang yang ditandai dengan bintik-bintik fluoeresen redup. Jika tidak ada fluoresensi, berarti tidak ada molekul DNA yang berhibridisasi, menunjukkan bahwa gen tidak aktif. Para peneliti sering menggunakan teknik ini untuk memeriksa aktivitas berbagai gen pada waktu yang berbeda. Jika sampel co - hibridisasi Tumor (warna merah) dan sampel Normal (warna hijau), akan  bersaing untuk sintesis komplementer DNA pada slide microarray. Jika ada bintik merah, berarti ada gen  yang mengekspresikan tumor dibandingkan yang normal (upregulated  dalam canker). Jika terdapat spot (bintik) hijau, berarti  gen  dalam jaringan normal (down regulated in cancer ). Jika terdapat spot warna kuning, berarti  ada gen tertentu yang sama-sama mengekspresikan normal dan tumor.

Prinsip yang digunakan adalah mengandalkan kemampuan DNA sampel yang telah dilabel dengan zat fluorescent untuk melakukan rekombinasi dengan probe yang telah ada pada chip microarray dengan cara hibridisasi atau mensintesis cDNA dari RNA yang diisolasi dari dua kondisi yang berbeda (misal sel tumor dan sel normal), kemudian dilakukan penandaan dengan menggunakan unsur radioaktif fluorosens multiwarna. cDNA yang telah dilabeli ini kemudian dihibridisasi dengan sejumlah besar gen dari pustaka gen. Hasil hibridisasi kemudian dianalisis dengan menentukan intensitas fluorosens relatif untuk masing-masing gen dengan menggunakan scanner laser.

G. Aplikasi Dalam Bidang Farmasi

1.      Uji DNA HPV (Human Papillomavirus)

Uji DNA HPV telah dipakai sebagai uji tambahan paling efektif cara mendeteksi keberadaan HPV sedini mungkin. Uji DNA HPV dapat mengetahui golongan hr-HPV atau lr-HPV dengan menggunakan teknik HC II atau dengan metode PCR, uji DNA HPV juga dapat melihat genotipe HPV dengan metode DNA-HPV Micro Array System.

Metode  DNA-HPV Microarray :

DNA-HPV Micro Array adalah metode  yang digunakan untuk mengetahui genotipe HPV  DNA-HPV Micro Array dapat men-deteksi 24 genotipe HPV : HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-34, HPV-35, HPV-39, HPV-40, HPV-42, HPV-43, HPV-44, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-53, HPV-54, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, dan HPV-70. Prinsip kerja DNA-HPV Micro Array : (1) eks- traksi sel untuk mengisolasi DNA, (2) DNA yang telah diisolasi kemudian diamplifikasi menggunakan PCR, (3) hasil amplifikasi di-hibridisasi menggunakan probe spesifik dari ke-24 genotipe HPV; proses hibridisasi ini memerlukan sejumlah DNA untai tunggal, (4) kemudian proses deteksi sehingga akan  terlihat genotipe-genotipe HPV pada sampel yang diperiksa.

2.      Pendeteksian kanker dari DNA microarrat ekpresi gen

Kanker adalah penyebab utama utama kematian dan respon jawab untuk sekitar 13% dari semua kematian di seluruh dunia. Cancer tingkat kejadian tumbuh pada tingkat yang mengkhawatirkan di  dunia. Sebagian besar pasien didiagnosis dengan kanker sangat terlambat. Oleh karena itu,  sangat penting untuk mencegah dan mendeteksi kanker lbh awal. Meskipun demikian, metode konvensional detecting dan mendiagnosis kanker hanya mengandalkan ketrampilan fisik, dengan bantuan pencitraan medis, untuk mendeteksi .Gejala yang biasanya muncul dalam tahap akhir kanker. Ekspresi gen microarray merupakan teknologi yang menjanjikan yang dapat mendeteksi sel kanker dalam tahap awal kanker dengan menganalisis gen ekspresi sampel jaringan. The microarray technologi kemungkinkan peneliti untuk meneliti ekspresi dari ribuan gen secara bersamaan. Untuk menurunkan  kompleksitas komputasi dan untuk meningkatkan kemampuan generalisasi dari sistem kami mempekerjakan gene selection berbasis entropi pendekatan untuk memilih gen yang relevan yang secara langsung bertanggung jawab untuk diskriminasi kanker.

3.    Aplikasi Microarray untuk kanker payudara

Salah satu aplikasi DNA Microarrays adalah untuk mengamati perubahan tingkat ekspresi genetik dari berbagai gen secara bersamaan. Jumlah gen yang diamati bisa puluhan, ratusan bahkan ribuan. Contoh aplikasinya adalah untuk meneliti kanker payudara dan respon pasien akan terapi yang diberikan untuk mengobati penyakit tersebut. Dengan DNA Microarrays ini dokter dapat memprediksi respon atau ketahanan pasien terhadap pengobatan, terutama pada kemotrapi. DNA Microarray menggunakan bahan solid, seperti slide kaca, chip silicon, atau membrane nilon yang di atasnya di-spot-kan ribuan bahkan jutaan molekul DNA yang mewakili gen-gen yang akan diamati yang bertindak sebagai probe. Dalam proses selanjutnya cDNA yang dibuat dari mRNA yang dihasilkan oleh ekspresi genetik pasien akan terhibridisasi pada spot DNA probe yang sesuai. Dengan menggunakan DNA Microarrays, ekspresi dari ribuan gen pada sampel tumor dapat diuji dengan satu penelitian. Beberapa hal yang perlu diperhatikan di dalam mengamati ekspresi gen ini adalah penggunaan cDNA dan oligonukeotida microarray. Secara umum, mRNA yang diekstraksi dari sampel biologis diubah menjadi cDNA utas tunggal dan diberi label fluorescence. Setelah itu diikuti oleh hibridisasi cDNA terlabel ke permukaan DNA microarray. Interaksi antara probe dan target dideteksi menggunakan detektor.Setelah itu analisis data dilakukan dan dapat diketahui bagaimana respon pasien pada pengobatan tertentu, identifikasi target yang menjadi akar masalah di dalam penyakit ini, dan pengobatan atau terapi apa yang tepat untuk diberikan pada si pasien. Setelah data dianalisis, maka dapat dilakukan terapi secara personal pada pasien sehingga pengobatan tersebut dapat efektif mengobati kanker yang diderita. Pada beberapa pengobatan kemoterapi secara umum, pengobatan dilakukan secara menyeluruh dan umum sehingga gen tumor dapat diatasi tetapi radiasi menyerang gen yang lain, seperti rambut yang mudah rapuh dan rontok sehingga tubuh pasien kadang kala tidak kuat untuk menahan efek samping tersebut. Karena itu terapi secara personal ini dapat menjadi hal yang berguna bagi pasien karena terapi yang dilakukan sesuai dengan respon imun dan ketahanan tubuh pasien (Brennan et al 2005).

4.        Pola ekspresi genetik dan farmakogenomik

Jenis gen yang dapat dianalisis dengan teknik ini tergantung pada ketersediaan DNA dari gen yang ada pada chip DNA. Apabila seluruh gen yang dimiliki oleh manusia sudah dikenali, kemudian semuanya dapat ditata pada chip DNA maka alat tersebut akan mampu menganalisis ekspresi seluruh gen yang terdapat di dalam sel manusia. Dalam prakteknya, teknologi ini membutuhkan alat bantu pengolah data yang berupa seperangkat komputer beserta software-nya. Teknologi ini akan membantu manusia dalam melakukan identifikasi seluruh sifat yang melekat pada seseorang. Selain itu teknologi ini juga akan dapat membantu manusia dalam melakukan diagnosis, memonitor dan memprediksi suatu penyakit, menemukan dan mengembangkan obat baru serta menentukan pilihan obat yang paling tepat untuk suatu penyakit dan pasien tertentu.

Saat ini masyarakat ilmuwan dunia yang tergabung dalam berbagai group, baik perusahaan komersial maupun Perguruan tinggi, telah berupaya untuk mengembangkan teknologi tersebut. Affymetrix (http://www.affymetrix.com ), sebuah perusahaan di bidang teknologi chip DNA, telah mampu memproduksi sebuah chip yang memuat lebih dari 60.000 jenis gene dalam bentuk fragmen DNA. Dua belas ribu di antaranya adalah gen-gen yang sudah dikenali berpengaruh terhadap kesehatan dan pengobatan.

Sementara itu, pemanfaatan chip DNA untuk analisis ekspresi gen manusia juga telah banyak dilakukan. Sebagai contoh misalnya Stanford University dan National Cancer Institute telah memanfaatkan teknologi ini untuk analisis klasifikasi tumor menggunakan chip DNA yang memuat lebih dari 30.000 jenis gen. Takara, sebuah perusahaan bioteknologi di Jepang juga telah mengembangakan teknologi ini melalui pengembangan instrumentasi dan metodologi untuk diagnosis kanker. Saat inipun Takara beserta beberapa perusahaan biomedical juga melakukan program analisis genomik (Dragon genomics) terhadap beberapa spesies dari laut yang ditujukan untuk pengembangan obat.

Diperkirakan perkembangan teknologi chip-DNA ini akan terus meningkat sejalan dengan kemajuan yang dicapai oleh program Human Genome Project. Pada sekitar satu atau dua tahun ke depan, seluruh gen manusia diproyeksikan telah dapat ditata dalam sebuah chip DNA. Sementara itu analisis fungsional seluruh gen tersebut juga segera dapat dilakukan secara serentak sehingga pada tahun berikutnya seluruh proses fisiologis, biokimia dan patofisiologis manusia sudah akan dapat diidentifikasi.

Lebih dari itu, teknologi chip-DNA yang didasarkan pada analisis fungsional genomik tersebut akan menawarkan paradigma baru dalam diagnosis dan terapi suatu penyakit serta pengembangan dan penemuan obat baru. Paradigma baru inilah yang selanjutnya melahirkan sebuah disiplin baru yang dinamakan pharmacogenomics

Ilmu pharmacogenomics akan berkembang dengan pesat pada tahun-tahun berikutnya, sehingga akan mampu mengidentifikasi sejumlah besar jenis penyakit yang ada pada manusia yang berhubungan dengan kelainan ekspresi gen (pola penyediaan protein). Selanjutnya juga akan dapat diidentifikasi mengenai kemungkinan adanya resiko munculnya penyakit-penyakit tertentu berdasarkan pola ekspresi gen, seperti misalnya, kanker, diabetes, kardiovaskular dan sebagainya. Pada tahun-tahun tersebut juga diperkirakan sudah akan diterapkan terapi gen untuk penyakit-penyakit tertentu seperti kanker, jantung dan hemofilia. Di samping itu penemuan obat baru dengan target yang spesifik juga berkembang dengan pesat. Seluruh jenis obat, pada saat itu, telah diketahui pengaruhnya terhadap ekspresi gen-gen tertentu sehingga dapat diketahui khasiatnya serta efek sampingnya dengan lebih jelas.

Metoda DNA microarray memungkinkan untuk menganalisis pola ekspresi genetik global yang mencerminkan sifat tanggapannya terhadap suatu perlakuan (misalnya obat) yang meliputi farmakokinetik, farmakodinamik dan efek samping. Di samping itu metode ini juga dapat untuk menganalisis dan memperkirakan sifat pola penyakit dan tanggapannya terhadap suatu perlakuan. Keterangan lebih jelasnya dapat dilihat di dalam naskah.

Pada tahun-tahun berikutnya akan dilakukan identifikasi pola-pola ekspresi gen pada tiap-tiap individu juga dengan teknologi chip-DNA. Identifikasi genetik individual ini memungkinkan setiap individu untuk memiliki kartu identitas genetik masing-masing. Di sisi lain kemajuan bidang ilmu bioinformatics yang ditunjuang dengan sistem komputerisasinya memungkinkan untuk dapat menganalisis identitas genetik yang dimiliki tiap-tiap orang sehingga akan diketahui sifat-sifat fenotipnya. Selanjutnya, melalui pendekatan ilmu pharmacogenomic dan pharmacoinformatic, kartu identitas genomik dari tiap individu ini dapat dianalisis untuk menentukan sifat responsifnya terhadap tiap-tiap obat yang diberikan (respon individual terhadap obat). Respon individual terhadap obat ini meliputi pengaruhnya terhadap nasib obat di dalam badan (farmakokinetik: absorbsi, distribusi, metabolisme dan eliminasi), dan disposisi obat termasuk interaksi obat dengan molekul biologi sebagai target reaksinya (farmakodinamik). Pengetahuanyang teliti mengenai respon individual ini selanjutnya digunakan untuk menentukan khasiat obat serta efek sampingnya yang juga bersifat individual. Oleh karena itulah maka obat yang dikonsumsi oleh masyarakat juga akan bersifat individual yang didasarkan pada analisis genomik.

5.    DNA Profilling

Salah satu aplikasi microarray DNA dalam biologis kanker adalah untuk mempelajari proses metastasis pada tumor. Untuk beberapa kasus tumor, tumor yang semula berada di dalam sel, kemudian berkembang dan menyebar ke organ lain, misalnya tulang. Untuk mempelajari urutan DNA sebagai penyebab munculnya metastasis tumor dapat dilakukan melalui teknik microarray DNA.

Melalui suatu teknik isolasi secara in vivo diperoleh sel tumor yang telah mengalami metastasis dan urutan DNA tersebut kemudian dibandingkan dengan sel tumor yang belum mengalami metastasis.

Studi microarray telah digunakan untuk mempelajari urutan DNA penyebab metastasis tumor pada otak. Aplikasi lain dari microarray DNA adalah identifikasi dan analisis gen yang telah mengalami mutasi, penelompokkan tumor, identifikasi biomarker tumor dan drug discovery.

6.     Protein Profilling

Suatu array antigen, protein dan juga peptida berguna untuk studi mengenai fungsi biologis protein dalam suatu organisme melalui suatu pengukuran interaksi protein-protein, protein-asam nukleat, protein-molekul kecil, dan enzim-substrat. Suatu array peptida dan protein juga dapat digunakan untuk menentukan respon imun atau karakterisasi autoantigen dalam suatu penyakit autoimun. Contohnya, Robinson et al. telah mengkoleksi dan menyusun ratusan peptida yang merupakan autoantigen dalam sistem lupus erythematosus dan rhematoid arthritis. Setelah serum darah diinkubasi pada chip, ikatan antibodi menunjukkan reaktivitas immunologis terhadap protein yang bersangkutan. Penggunaan peptida arrays memberikan hasil yang lebih baik untuk pemetaan dari penyebaran sisi autoreaktif. Sebagai tambahan, pola penyebaran reaktifitas antigen pada individu dapat digunakan untuk merencanakan proses perawatan/pengobatan terhadap penderita.